NatureMethods
用于原位组织分析的高精度空间转录组学
在大规模的单细胞RNA测序中，我们可以绘制成千上万个解离的单个细胞的基因表达图谱，但是我们并不能保留他们的空间位置，在还原细胞位置时，会产生很大的偏差，因此研究空间基因表达对理解组织中的身份和功能都是至关重要的，但这也是具有挑战性和前言研究领域。随着技术创新的不断出现，许多优化操作的简易性，准确性，检测基因数量、种类或空间分辨率等方面的方法技术逐渐被开发出来。
年9月9日，来自KlarmanCellObservatory的SanjaVickovic及其研究团队在NatureMethods上发表题为“High-definitionspatialtranscriptomicsforinsitutissueprofiling”的研究文章。他们开发了高分辨率空间组学技术，利用空间条形码磁珠从组织切片上捕获RNA，结合RNA-seq进行组织的基因表达分析，揭示组织的空间信息和分子特征。这种技术的可行性在研究小鼠脑癌和原发性乳腺癌中得到了证实。这为细胞和组织的高分辨率空间分析开辟了新的道路。
当前所使用的空间转录组学（ST）是一种引入空间条形码的RNA-seq方法，能在许多系统中研究转录组的空间信息，但是其分辨率仅有μm，一次大约可覆盖3-30个细胞，并且不同的芯片孔之间存在空隙。为了扩大组织的覆盖范围，提高分辨率，SanjaVickovic研究团队开发了高精度空间转录组学（high-definitionspatialtranscriptomics，HDST）。在HDST中，他们将磁珠连接到空间条形码化的寡核苷酸上，形成的独特的组合磁珠。阵列中还有多个2μm的小孔组成的六边形矩阵，将每个组合磁珠以随机排列的方式分别放入到2μm的小孔中，由此制造出磁珠阵列。然后通过顺序杂交和纠错策略解码每个磁珠的位置。将组织进行冷冻切片后，把组织放在解码的磁珠阵列上，进行HE染色和成像后，就可捕获RNA，结合RNA-seq进行分析（如图1），实现了高精度无间隙的空间组学分析。
图1HDST流程图
SanjaVickovic研究团队为了测试HDST的可行性，他们用split-pool的方式标记了近万个单独编码的磁珠，随机放入超过万的小孔里。首先在小鼠大脑的嗅球（mainolfactorybulb,MOB）上进行组织分析。（嗅球系一扁卵圆形的灰质块，为嗅觉的初级中枢。自表面向内可分为6层：嗅神经纤维层、突触小球层、外颗粒层、帽状细胞层、内颗粒层、嗅束纤维等，是由跨多个形态层的神经元细胞组成。）评估HDST的分子数据是否能分析嗅球中各个组织层之间的联系，利用HDST通过两种关键性任务测定HDST的性能：（1）组织中生成单个基因的高分辨率空间表达模式。（2）检测出细胞类型并分配到正确的高分辨率位置。
研究团队测定HDST数据的有效性后，他们对HDST数据进行监督分析，识别嗅球特定形态学层的基因表达特征。首先利用HE染色注释形态学层，可以看到组织边界有明显的空间原位分布。通过lightbinning增强信号，读取每个细胞转录本的表达数据，合并数据后通过平滑的高斯滤光器处理，进行双侧t检验确定特定各个形态学层的差异表达基因的特征（图2）。
图2形态学层的差异基因表达情况
与此同时，研究团队还利用HDST检测细胞类型的空间分布，他们开发了多项式朴素贝叶斯分类器，通过与scRNA-seq数据集成，将稀疏的高分辨率HDST数据映射到单个细胞类型上。然后，我们需要分配HDST数据进行后续的分析，根据与HDST匹配的HE图像，采取不同的细胞分配方式，一种是对单个细胞核中相关的磁珠进行分离，将细胞核分段，形成“sn-like”；另一种细胞分配方式是以对数的方式计算，以单个细胞为单位进行分离大约5个小孔为一个单位，这种分配方式称为“sc-like”。研究组利用这两个细胞分配方式对各细胞类型进行分配，就可分析出在各个形态层相关细胞类型的富集情况（如图3）。通过HE成像和HDST数据的结合，可以帮我们了解细胞类型的空间分布，以及细胞类型在各组织层中的分布模式，了解各形态学基因的差异表达谱。使让我们对器官组织中细胞的分布有了更直观的认识，有助于我们更好的了解组织器官的功能。
图3sn-like和sc-like细胞类型的富集
HDST帮助我们将组织病理学和基因转录表达谱相结合，促进了我们对疾病的研究以及对患者的诊断及治疗的理解。SanjaVickovic研究团队为了检验HDST的临床应用潜力，他们利用HDST对3级乳腺癌HER2+患者的乳腺肿瘤组织进行分析。分析组织中空间差异表达基因和细胞类型的分布（如图4）。提供关于癌症诊断中的疾病异质性的信息，帮助我们更深入的了解乳腺癌发生的病理特征，推动疾病机理的研究。
图4HDST分析乳腺癌组织的细胞类型和空间基因差异表达模式
HDST是一种在健康和病理组织中测量原位空间信息的高分辨率的方法。和传统的空间转录组学相比，HDST具有更高的分辨率，信号的特异性很强，但仍有不足的地方：HDST捕获的数据相对比较稀疏，期待后续技术的改进。
笔者认为，HDST设计巧妙的地方在于磁珠的设计和磁珠阵列的解码，磁珠阵列的形成采用了splitandpool的方式。每个磁珠的设计上，都加入了三段特异性的空间条形码，独一无二的磁珠随机分布在六边形小孔中，形成磁珠阵列。然后，在多个互补寡核苷酸的独特组合形成的解码池中进行解码，采用了3个顺序杂交的方法，每次杂交会被标记成相应的颜色，记录荧光产生读数，形成“唯一颜色代码”，通过荧光检测在阵列上追踪磁珠空间位置（如图5）。每个空间位置都对应到“唯一颜色代码”，完成磁珠阵列的解码。当组织切片与磁珠阵列结合后，就能实现在原位组织上分析转录组的信息。
图5磁珠的合成和解码
