近日，美国Swansea大学的WilliamJ.Griffiths教授课题组在AnalyticalChemistry杂志上发表题为“VisualizingCholesterolintheBrainbyOn-TissueDerivatizationandQuantitativeMassSpectrometryImaging”的文章，该文章采用组织酶辅助衍生化策略结合质谱成像技术提高了检测脑组织切片中的胆固醇含量分布，并细致地对不同成长周期小鼠与C1型尼曼-匹克模型小鼠特定结构的胆固醇水平及进行了分析。
胆固醇是动物质膜上最丰富的脂质分子之一，它可被代谢成氧甾醇，类固醇激素和胆汁酸。这些中间体和代谢产物是具有积极的信号分子，在大脑中有部分通路起着重要作用，因而固醇内稳态和信号转导涉及到一些人类疾病，包括神经退行性和神经发育状况。然而在ESI-MS和MALDI-MS中，胆固醇分子离子化效率很低，主要以加铵峰或质子化失水峰为主，使其难以质谱成像，目前只有ToF-SIMS可用于高灵敏度的胆固醇质谱质谱成像，但是ToF-SIMS是一种表面敏感技术，胆固醇已经被证明会迁移到表面并结晶，覆盖了组织中的其他局部共存的物种。
图1
此前，该课题组在溶液中对固醇开发了酶辅助衍生化方法(enzyme-assistedderivatizationforsterolanalysis,EADSA)进行分析。固醇分子首先与胆固醇氧化酶进行反应，3β-羟基转化为3-oxo，然后与Girard-P(GP)联氨试剂结合生成带电荷标记的腙(如图1A)。在这篇文章中，作者用[2H7]-Chol作为内标首先均一喷涂在组织上，再先后喷涂胆固醇氧化酶和GP进行孵育完成组织酶辅助衍生化，最后喷涂CHCA基质进行MALDI成像或直接进行DESI成像。该方法的优点主要有四方面：(1)极大地提高了灵敏度(相较衍生化前信号强度提高约倍)。(2)可以进行绝对量化。(3)增强了结构信息。(4)增强了分析的特异性。
图2
使用MALDI-TOF得到每个像素的m/z.4(Chol-GP)和m/z.4([2H7]-Chol-GP)强度信息并以.4作为标准进行归一化即可得到Chol定量质谱成像图(图1C)。作者还用AP-MALDI(质谱仪器为OrbitrapElite)对组织中的.4和.4与标准样品衍生化得到的.4和.4进行了MS3的分析(图2A、B为组织中.4和.4的MS3，图2C、D为标准品衍生化的MS3谱图。碎裂机理如图3所示，MS2丢失了吡啶环，对丢失吡啶环的碎片离子进行进一步MS3)，发现基本一致，从而对这两个分子的结构信息得到了确认。图2E为.4→.4→MRM得到强度数据进行的成像，图2F为.5→.4→MRM得到的强度数据成像图，可以看出内标比较均匀但确实存在基质效应引起的部分强度变化。由于当前软件不允许对MS3信号归一化到内标，后续的成像所用的都是MS1中相对内标归一化的结果。
图3
作者对WildType成年鼠的脑进行定量MSI分析(图见原文)，发现胆固醇在脑桥(pons,P,.6±.9ng/mm2)和小脑白质(cerebellarwhitematter,CBXWM,.0±.8ng/mm2)最多，在嗅觉区(olfactory0.traits,OLF),皮质(cortex,CTX)和海马体(hippocampus,HP)的含量最低，分别为.5±52.4,.8±32.5,and.3±31.6ng/mm2。有趣的是，晚期胆固醇生物合成酶基因转录产物的分布与高胆固醇丰度区域，即中脑、髓质和脑桥区域相匹配。
图4
与ToF-SIMS相比，该方法可以同时对其他脂质进行监测，特别是在使用大气压离子源时。为了展示方法的潜力，该工作报告了PC32:0(m/z.，虽然该峰也可分配为PE35:0，但是奇数链脂质较少所以被认作PC)归一化到[2H7]-Chol-GP的MSI图(图4B)。PC32:0分布梯度与胆固醇呈现相似的趋势。
作者用EADSA-MSI测量小鼠各成长周期的全脑，发现新生儿的胆固醇密度约为ng/mm2，而在第10周成为成熟鼠时约为ng/mm2，增长了三倍。此外，作者对患有C1型尼曼-匹克病(神经鞘磷脂酶缺乏致神经鞘磷脂代谢障碍)小鼠的脑进行了质谱成像，发现NPC1蛋白(溶酶体膜上胆固醇转运蛋白)缺失使得鼠脑胼胝体和其他区域的胆固醇含量显著降低，在分子水平上说明了该类区域呈现低髓鞘现象的原因。
该工作还使用了多种离子源(真空MALDI、AP-MALDI、DESI)和质量分析器(Q-TOF，线性TOF,Orbitrap)进行了EADSA-MSI的评估，发现该EADSA-MSI在各种分析仪器上都可重复和比较稳定。
综上所述，作者利用组织酶辅助衍生化策略结合质谱成像技术提高了检测脑组织切片中的胆固醇含量分布的能力，在神经病理学研究上为揭开胆固醇在阿尔茨海默氏症和多发性硬化症等疾病的重要作用提供了强有力的工具。
通讯作者简介：
ProfessorWilliamJGriffiths(WJG)in
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