摘要
淀粉样变性是致病蛋白异常沉积所导致的异质性疾病，病理学检测是定性与沉积蛋白精准分型诊断的关键。组织原位特异性染色联合质谱检测技术是近年来淀粉样变性的新型检测技术，可有效提高检测的准确性和微小活检组织及淀粉样变性早期的检测敏感性，弥补传统技术的缺陷，实现“金标准”检测。现就淀粉样变性组织学检测的传统技术以及本项技术的应用价值进行综述。
正文
淀粉样变性是淀粉样纤维在细胞外空间系统性或局部沉积所致器官功能与结构损害的一组异质性疾病。其发生机制是异常前体蛋白错误折叠形成不稳定的自动聚合物导致淀粉样原纤维形成β折叠结构，常累及包括心脏、肾脏、肝脏、胃肠道、神经等系统，会引起系列的临床症状，临床表现多样化，诊断与治疗困难［1］。近年来随着人们对于淀粉样变性疾病研究的深入和新型检测技术的综合应用，淀粉样变的病例报道呈现逐年上升的趋势［2］。英国血液病学会标准委员会和美国梅奥诊所各自制定的系统性轻链型淀粉样变性诊治指南在国际上最具代表性，我国刘志红在年主持撰写了中国的系统性轻链型淀粉样变性诊疗指南［3］、周道斌主持撰写了中国原发性轻链型淀粉样变的诊断和治疗专家共识［4］，明确诊断与精准分型已成为淀粉样变性的诊疗关键，具体包括临床表现、病理组织学检测特异性染色明确淀粉样沉积物存在和淀粉样变沉积蛋白精准分型鉴定，故针对淀粉样物质及沉积蛋白创新应用多种方法学联合检测其本质即沉积蛋白精准分型的研究始终是核心与热点问题。我们就淀粉样变性的定性确认与沉积蛋白精准分型中组织原位特异性染色联合质谱检测技术的应用价值进行分析。
一、组织学中淀粉样变定性的检测技术
年，Colin和GaultierdeClaubry发现淀粉与碘、硫酸存在蓝色染色反应，年Virehow等在尸检中发现经HE染色的组织在光镜下有无定形物沉积于神经系统的细胞间质中，并能与碘化物起化学反应，并首次提出了淀粉样蛋白（amyloid）这个名词。在随后的病理学检测中，人们逐步发现沉积于不同器官的淀粉样物质在大体观察下有些呈现致密的“陶瓷样”或“蜡样”外观，而有些并无特异性。
年Bennhold首用刚果红进行蛋白质聚集体淀粉样性质的检测，至今仍为传统的经典技术［5］，是确定组织样本中淀粉样蛋白存在与否的组织学检测金标准［2］。刚果红与淀粉样蛋白在体外的结合导致其吸光度峰由nm向nm转移，并在约nm处出现一个独特的肩峰，光镜下显示为砖红色。更典型的特性是淀粉样蛋白是通过与刚果红结合后增加的光学各向异性可在偏振光镜下观察时出现苹果绿双折射光，由此提高了检测的灵敏度，但其与石蜡切片的厚度相关，Wolman推荐8~10μm厚度观察效果最理想，切片太薄会出现假阴性，切片过厚会呈现黄色双折射光。目前已有甲醇刚果红（Highman）、高锰酸钾刚果红、碱性刚果红、Stocks刚果红等染色方法进行淀粉样变初步定性与淀粉样轻链蛋白（AL）、淀粉样蛋白A（AA）粗略鉴别的应用。中国系统性轻链型淀粉样变性诊治指南［4］的组织学诊断标准中要求刚果红染色和高锰酸钾预处理后刚果红染色同为阳性，且在偏振光镜下观察有苹果绿双折射光。邹万忠教授推论高锰酸钾的氧化作用是破坏了AA的分子结构或引起β片层结构改变，故复染刚果红后不着色，而淀粉样轻链蛋白未受破坏或另有与刚果红结合的位点，其复染后显色。周展眉和曹维［6］比较肾淀粉样变高锰酸钾刚果红染色法后得出酸化甲醇法较Bennhold法和Alkaland在阳性染色准确性、敏感性和染色强度最优。年Yakupova等［5］进行刚果红与淀粉样蛋白系统性研究中发现刚果红除了与淀粉样蛋白集合外还与非淀粉样物质结合，存在非特异性与局限性；ElTers等［7］报道了纤维素肾小球肾炎（FGN）纤维的形态与淀粉样纤维相似，电镜下直径（范围11~18nm）大约为淀粉样纤维（8~10nm）的2倍，在罕见情况下FGN纤维可出现疑似刚果红阳性染色的情况，故对刚果红染色判断需谨慎。
硫黄素T因其荧光性较强，能清晰可见较小的沉积物，年Vassar和Culling推荐应用于淀粉样物质的染色，年Elghetany亦提出其对于淀粉样物质染色存在特异性，国内报道了0.1%硫黄素T在皮肤淀粉样变中染色效果最佳。另组织中的类纤维蛋白、角质素、Paneth细胞、酶原颗粒等对硫黄素T均具有亲和力，故可将其与硫黄素S一样仅作为刚果红染色的验证方法，但特异性不能过高估计。
免疫组织化学（IHC）和免疫荧光是以抗原抗体反应为基础的常用技术，现已有如AL、AH、AA、ATTR、AFib和Aβ2M等淀粉样变致病蛋白抗体可进行分型检测，优点是检测技术成熟、方便快捷、成本低，缺点是已发现的沉积蛋白类型达36种［8］，而可用于检测的一抗不足10种，且因易受血浆蛋白污染产生非特异性背景而判读困难，同时致淀粉样蛋白在发生结构修饰过程中由于抗原表位的丢失而可能出现漏诊和误诊等问题，另外对单个样本进行多重染色因操作繁琐，效果并不理想。有研究报道肾活检淀粉样变冷冻组织行免疫荧光结果优于石蜡组织［7］，而在石蜡组织免疫荧光染色前蛋白酶K消化较抗原热修复、胃酶及胰酶效果好。另一研究显示，IHC进行淀粉样变性的成功率为38%~87%，免疫荧光成功率较高为65%~87%［9,10,11］。我们在检测中发现免疫荧光后荧光显微镜或共聚焦显微镜观察可避免非特异性背景干扰，镜下观察效果显著优于普通光镜观察。
透射电镜（transmissionelectronmicroscopy）是以电子束作为照射源，高速电子束穿透超薄样本后逐级放大，并在荧光屏成像，分辨率通常可达0.2nm。淀粉样物独特的原纤维排列超微结构特征是细胞外间质组织中常有直径7.5~10.0nm、大量杂乱无序排列的原纤维丝沉积，每条纤维包括两个2.5~3.0nm的电子致密丝，致密丝间隔为2.5nm，应用透射电镜可进行极高分辨率的病理观察。徐缓和雷松［12］对肾脏、腹壁脂肪、直肠黏膜共21例淀粉样物质沉积光镜与透射电镜诊断阳性率进行比较，后者的阳性率分别为90.5%（19/21）、66.7%（14/21）和42.9%（9/21），显著优于前者的76.2%（16/21）、38.1%（8/21）和9.5%（2/21）。吴敏霞等［13］报道肝淀粉样变早期临床肝功能检测未见受损，但在透射电镜下清晰可见肝组织内出现的极少量淀粉样细丝沉积于肝窦周间隙，阻碍肝细胞获取营养物质，并可随着淀粉样物质沉积量的增加，肝细胞受损加剧，表现为受挤压、萎缩，微绒毛减少，进一步发展造成肝细胞裂解，形成裸核。淀粉样变早期的组织学改变轻微尤其是淀粉样物质沉积量较少时会导致刚果红染色结果有时出现假阴性，应用透射电镜可提高早期诊断的阳性率。
免疫电镜技术（immuno-electronmicroscopy，IEM）是利用电子显微镜在超微结构水平上观察以铁蛋白、酶标、胶体金标记的抗体与某些抗原特异性结合从而进行定位、定性、半定量的一种方法。虽然透射电镜观察淀粉样纤维细丝的分布最具敏感性，但要明确早期淀粉样变AL型的诊断还需进行IEM胶体金法标记（κ、λ）。王素霞通过对15例肾早期淀粉样变检测研究发现TME联合IEM是确定诊断的有效手段，尤其是轻链蛋白（κ、λ）分型［14］。但目前应用铁蛋白与酶标标记进行IEM淀粉样检测的报道尚少见，同时IEM也有可检测抗体种类不足的困境。
二、分子病理学及蛋白组学在淀粉样变性沉积蛋白检测分型中的应用
目前36种人淀粉样变沉积蛋白中，仅14种与系统性淀粉样变有关，19种为局部形式，伴随致淀粉样变性的蛋白性质逐渐明确，以致病蛋白种类为分型的方法较既往原发性、继发性、遗传性更能准确地揭示病因而受到广泛认可［8］。
基因检测有助于遗传性淀粉样变的诊断，降低不典型患者的漏诊率及误诊率，但遗传性和AL型淀粉样变性均为系统性淀粉样变性的常见原因，两者临床表现类似，分型时需谨慎对待。基因检测应作为其他分型方法的必要补充，但结果判读还需结合具体情况，同时检测耗时长，费用高，临床普及开展困难［15］。
年Lavatelli等［16］首用蛋白组学技术对新鲜存有淀粉样物质的皮下脂肪进行检测的研究获得突破，二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）联合基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）技术在完全明确标本的蛋白沉积物种类方面有明显优势与潜力，由此质谱蛋白组学分析成为特异而敏感的检测淀粉样变方法。乳铁蛋白是继发性角膜淀粉样变性前体蛋白之一，可能因倒睫的机械刺激损伤角膜上皮导致泪液来源有构象变化的乳铁蛋白进入角膜上皮下引发系列的继发性角膜淀粉样变性，有研究显示野生型乳铁蛋白不能形成淀粉样纤维，而GluAsp基因突变型乳铁蛋白通过上皮细胞的胞外空间渗透到淀粉样蛋白沉积部位，但具体病变机制目前尚未明确［17］。所以在角膜淀粉样变性的组织学检测中，针对送检的微小活检组织标本，需要预先综合评估与设计检测技术路线，在非常有限的材料中进行淀粉样变性的定性与沉积蛋白分型诊断，质谱检测是有效的技术之一。质谱检测的优势在于直接检测致病蛋白、检测所需标本量少、致病蛋白信息全面并可发现新的以及伴侣蛋白、兼顾冰冻标本及石蜡切片标本。但是蛋白组学检测亦存在缺陷，如送检标本在甲醛固定过程中会发生蛋白以及核酸的共价化学修饰与交联导致结构变化而可能影响检测结果、质谱检测结果与蛋白含量及蛋白优化提取相关、蛋白组学检测技术目前尚未普及［18］。
三、组织原位特异性染色联合质谱技术的优势
淀粉样变的发病机制复杂、许多诸如淀粉样物质的产生、运输、清除等问题尚未明了，而且治疗困难。新近研究显示淀粉样变的治疗方案与构成沉积蛋白的分型密切相关，故研究淀粉样变沉积蛋白精准分型的检测技术显得十分必要与重要。
组织原位特异性染色联合质谱技术的优势在于：
1.有效提高检测的特异度与灵敏度：通过对石蜡切片标本HE染色光镜下细胞外红染无结构物质进行特异性刚果红染色包括高锰酸钾和草酸的预处理后再次刚果红染色、偏振光镜下观察，在活检标本量充足前提下建议常规透射电镜检测可发现淀粉样变性的早期病变，在上述基础上应用显微切割技术靶向原位提取阳性组织进行质谱检测可减少无关蛋白的污染，提高沉积蛋白检测的准确性。年梅奥诊所首次通过激光显微切割联合质谱检测（LMD/MS）技术成功鉴定神经组织内蛋白沉积物成分为SAP和限制性λ轻链。年Vrana等［19］应用该技术对已确诊淀粉样变亚型的标本回顾性检测，结果显示其准确性与特异度均为%。年Sethi等［20］对例肾淀粉样变标本进行该方法检测，例明确了亚型。年Sethi等［20］报道了通过此技术进行的12例肾凝胶蛋白淀粉样变的临床、活检和质谱检查结果。
2.检测信息更全面：应用高灵敏、全扫描型质谱，可以一次性地扫描样本中存在的所有蛋白，而不必针对不同淀粉样变性病例设计不同的探针/抗体。这样大大提高了质谱的通用性，简化操作步骤。部分如角膜的微小病变，可直接提取组织进行透射电镜和/或质谱检测；质谱检测因其标本用量少、灵敏度高、蛋白检测谱广，无需逐一测定各个亚型的特点而作为首选，在条件许可下进行结合电镜检测。
3.增加对新的致病蛋白和伴侣蛋白发现的可能性：通过应用最新的质谱检测技术，尝试发现新的致病蛋白和伴侣蛋白。目前对淀粉样变性蛋白的多级沉积、致病机制还不清楚。因此，全扫描质谱可以尽可能检测到病变组织伴随的首要淀粉样蛋白和次要淀粉样蛋白，同时还能发现伴随着蛋白逐步沉积的一些伴侣蛋白（如SAP和载脂蛋白家族等）。这对深入了解淀粉样变性疾病成因和发展机制有着重要的意义。
4.实施对诊断致病蛋白亚型治疗效果的研究：与临床协作追踪不同淀粉样变沉积蛋白亚型患者的治疗效果，并探索药物药理机制。淀粉样变性疾病的治疗，目前还局限于化疗、免疫抑制和自体干细胞移植等全身性的治疗手段，尚未有专门针对淀粉样蛋白的治疗手段见报道。因此，精确的淀粉样蛋白分型可以和各型蛋白独特的药物作用和代谢机制相结合，最终可能研发出相应亚型蛋白的特异药物。由此，提供淀粉样变性疾病治疗的新思路和新手段。
组织原位特异性染色联合质谱检测技术方法有高的临床应用价值，可迅速提高组织学标本检测能力以及结合不同脏器深入开展淀粉样变沉积蛋白研究。
四、总结与展望
淀粉样变性诊疗的关键是明确诊断与精准分型，包括特征性的临床表现、病理组织学检测明确淀粉样沉积物存在和沉积蛋白精准分型鉴定，基于组织原位的病理学检测在继发性淀粉样变的定性及沉积蛋白分型中有重要作用，目前淀粉样物质及沉积蛋白进行不同方法学及创新应用质谱等多种方法学联合检测其本质即沉积蛋白精准分型的研究始终是核心与热点问题。Sethi等［20］提出免疫透射电镜和LMD/MS都是敏感和特异的方法，检测结果上有互补性，优于免疫组织化学方法，在检出率方面可将透射电镜的91.6%和MS的88.8%融合提高到%。所以针对特殊部位的微小活检病变，常规检测效果不佳，重复检测浪费组织，可预先合理评估采用组织原位特异性刚果红染色初步评价后行质谱检测效果价值更大。
目前新型优化的LMD/MS技术与传统方法相比具有明显优势被认为是淀粉样变性沉积蛋白亚型判定的金标准之一［14，20,21,22］，创新应用组织原位特异性染色联合LED/MS技术有可能成为新的标准化临床诊断模式。
所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
本文来源：汤鸿,武睿,朱颖炜,等.组织原位特异性染色联合质谱检测技术在淀粉样变定性及沉积蛋白精准分型中的应用进展[J].中华病理学杂志,,50(3):-.DOI:10./cma.j.cn--.-END-
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