从基因被发现，到中心法则被证实，到形形色色的基因检测技术的诞生，人类对生命的密码充满了无限的好奇。新的技术能够解锁新的认知边界，而新的认知又能够催生新一轮的技术创新，今人站在前人的肩膀上，推陈出新，踵事增华。火爆科研圈的空间转录组正是打开科研全新维度的一把钥匙！而空间转录组是何来路？实现策略又有几何？今天小编就与您详细分说！
近两年，空间转录组这一概念渐入人心。顾名思义，空间转录组是既能够保留组织空间位置信息又能够获得不同组织空间位点转录信息的一种技术，以10xGenomicsVisium技术为例，它融合了组织病理学、基因芯片、高通量测序、生物成像技术。大部分人似乎会对这个拥有未来科技色彩的名字产生距离感，但它确实并不是一个完全的新鲜事物。人们对组织原位转录信息的探索从很早就开始了，主要通过以下几种策略实现。
原位杂交
二十世纪七十年代，原位杂交技术（insituhybridization,ISH）诞生,其基本原理是利用核酸的碱基互补配对原则，将连接有特殊标记物的外源核酸探针与组织、细胞中的待测DNA或RNA互补配对，结合成核酸杂交分子，经相应的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。其中最早出现的是基于放射性同位素的ISH，后续因放射性同位素对人体的危害，出现了基于荧光素的ISH（Fluorescenceinsituhybridization，FISH）。当然这些技术最大的缺陷还是只能检测有和无的问题。年单分子RNA荧光原位杂交技术（smFISH）的出现，标志着彻底进入原位杂交定量时代。
smFISH技术利用很多短的寡核苷酸探针来靶向检测转录本。因为每个寡核苷酸只与一个荧光基团偶联，因此本身的信号微弱。然而多条寡核苷酸与同一转录本结合后，就产生了足够强度的荧光信号，最后通过对荧光信号的检测进行定量。smFISH方法的局限性在于荧光图像的信噪比有限，需要使用高数值孔径的物镜和高放大倍数，这限制了成像的面积。为此，年，加州理工学院的蔡龙教授开发出连续荧光原位杂交（sequentialfluorescenceinsituhybridizationSeqFISH）技术，该技术即为顺序杂交的多重smFISH方法，通过连续几轮杂交、成像和探针剥离。在每轮杂交中，对每个靶标使用一组预先设计好的编码探针多次检测单个转录物。然而多轮的杂交需要增加相应的smFISH探针，这使得SeqFISH既昂贵又费时。图1SeqFISH技术原理
针对SeqFISH技术的缺陷，年，哈佛大学庄小威教授发布了MERFISH技术（mutiplexederror-robustfluoresceneinsituhybridization），可以在单个细胞中鉴定数千种RNA的表达量和空间定位。MERFISH的工作原理是将生物条码分配给细胞的RNA，将它们与DNA探针文库杂交来表示这些条码，然后通过成像读出这些条码来确定单个RNA分子的身份。通过多轮成像，可以同时读出许多不同的条码。
图2MERFISH技术原理
在年，蔡龙教授也运用了与MERFISH技术相似的原理推出了seqFISH+，即使用包含侧翼区域的主探针一步定位，随后循环多次读取探针。基于探针的原位杂交方法，就不得不提及RNA-scope技术，在年由美国AdvancedCellDiagnostics公司开发，通过专利的双“Z”型探针设计以及“L”型信号放大器，使RNA原位杂交具有高度特异性、单分子检测的敏感性并有极高的信噪比，能够在单细胞水平同时定量多个RNA的表达，并提供完整的组织形态学信息。图3RNA-scope技术原理
原位测序
除了ISH外，原位测序（insitusequencing，ISS）技术相对来说属于一种门槛较高的技术，年，瑞典斯德哥尔摩大学Nilson团队发布了第一个ISS方法，该方法使用锁式（padlock）探针靶向已知基因。与基于杂交的技术相比，此方法具有检测SNV的能力。但靶标的数量有限（≈）。年成立的CARTANA公司，开始对ISS技术商业化推广。在后续，Nilsson的研究团队还开发出一种新方法，称为基于杂交的原位测序（HybISS）。与之前的方法一样，它采用锁式探针进行滚环扩增。不过，探针设计经过改进，提高了空间检测的灵敏度。年8月，该公司被美国10xGenomics公司收购。图4原位测序技术原理
上面所提到的方法是基于目标基因已知序列设计靶标探针，在年，哈佛大学GeorgeChurch团队发布了非靶向的荧光原位RNA测序方法（FISSEQ）。该方法主要是将RNA转化为交联的cDNA扩增子，然后在共聚焦显微镜上进行测序。年，成立了ReadCoor公司以实现该技术的商业化。年，该公司同样被10xGenomics公司收购。图5FISSEQ技术原理
显微切割
除了在空间原位进行RNA检测的策略外，科研人员尝试精密获取指定位置的细胞进行RNA检测，年，美国国家癌症研究所开发出了激光捕获显微切割技术（Lasercapturemicrodissectiontechnology,LCM），直接利用激光束在显微镜下从冰冻或石蜡包埋组织切片中切割组织区域并获取目标细胞。年，景乃禾团队开发了基于LCM的Geo-seq，将LCM与单细胞测序方法smart-seq2相结合，其分辨率可以达到10个细胞的水平，该技术转录本覆盖度高，且能够检测可变剪切，但其繁琐的实验流程以及较低的通量限制了这一技术的应用。图6GEO-seq技术流程
空间原位捕获
前面介绍的技术大多存在检测通量有限、操作繁琐或成本高昂等一系列问题，空间原位捕获技术正在努力克服这些缺陷。该类技术主要通过空间原位进行mRNA分子捕获，然后进行异位测序，其中不得不提的当然包括空间转录组技术（SpatialTranscriptomics，ST），年，瑞典卡罗琳斯卡研究所及瑞典皇家理工学院发布了该技术，该技术将薄的组织切片放在载有空间标记条形码RT引物的载玻片上。组织被固定、染色、成像和透化。在透化过程中，mRNA分子垂直向下扩散到芯片表面，poly（A）与RT引物的ployd(T)端杂交，原位逆转录，移除组织后进行文库制备和测序（NGS）读数。该方法单点检测直径为um，共可检测个空间位点。年底，10xGenomics公司收购该技术后，对其进行了升级，升级后的10xVisium单个检测位点直径为55um,检测位点数量增至个，10xGenomics近日宣称未来该技术将兼容FFPE样本且检测分辨率可能进一步增加。目前该技术也是商业化应用最成功的空间转录检测技术之一。图7ST/10xVisium技术空间原理
年，哈佛大学和麻省理工学院FeiChen和EvanZ.Macosko合作发布了Slide-seq技术，该技术将独特的DNA条形码编码的微珠（直径=10um）包装到橡胶涂层的玻璃盖玻片上，由于珠子的位置事先未知，因此在样品制备过程之前，需要对珠子条形码进行原位解码。整个方法在概念上与ST方法相似，在该方法中，组织切片的透化使mRNA垂直向下扩散至表面的条形码珠，随后对条形码RNA文库进行测序。
图8Slide-seq技术原理
年，该技术发布了V2版本，提高了检测分辨率，单细胞检出率可达50%，且相比于上一代有更高的转录本检出率。
年，Nanostring发布了商业化空间组学平台GeoMXDigtalSpatialProfiler，该技术与其他技术相比最大的优势在于其能够兼容FFPE样本，同时支持RNA和蛋白的检测，可选择10um以上的感兴趣区域（regionofinterest,ROI），目标区域RNA由靶向探针进行捕获，并通过UV光敏感的linker连接一段寡核苷酸条码序列，通过紫外光照射后切割回收条码序列，最后通过NGS测序或Nanostring独家的ncounter进行表达定量检测。该平台目前支持种常见癌症相关基因和近百种肿瘤免疫相关蛋白的检测，预计在今年，该平台将支持人和小鼠0+基因的全转录panel。
图9GeoMxDigtalSpatialProfiler技术原理
年，耶鲁大学樊荣团队开发了基于微流控的DBiT-seq（DeterministicBarcodinginTissue）技术，其原理为利用包含50个平行微通道的微流控芯片在组织切片样本中引入DNA条形码A和B。首先原位反转录合成第一链cDNA，则该cDNA链引入了条形码A，随后再引入DNA条形码B。经过两步标记，组织切片在交叉点进行条形码的原位连接，形成不同的组织像素点，每个像素点都含有条形码A和B的不同组合，形成二维图像，将组织形态与空间组学相关联。此外，该技术还同时支持蛋白的检测，组织切片可被22个抗体衍生的DNA标签(Antibody-DerivedDNATags,ADTs)混合染色。最终，在形成一个空间条形码组合后收集cDNAs进行扩增建库测序。
图10DBiT-seq技术原理
更多的技术不再一一赘述，空间组学作为继单细胞组学的又一热点研究趋势，未来必将出现更多的技术，这些技术可能会兼容更多类型的组织样本，达到更高的分辨率，检测更多的基因数量，并实现真正意义的空间多组学研究。
博奥空间转录组测序
博奥生物旗下博奥晶典作为国内第一批引进10xGenomics平台的公司，率先搭建了完善的空间转录组实验平台。目前已经完成了多个样品、50多种不同样品类型的服务，覆盖的物种和样品类型包括人和小鼠的脑、眼球、口腔、心脏、肝脏、肺脏、肾脏、肠、胃、卵巢、前列腺等，在空间转录组测序方面具有丰富的项目经验。
博奥晶典已获得空间转录组、单细胞转录组、单细胞ATAC、单细胞免疫组库4个服务产品的官方CSP认证，成为目前国内唯一一家同时获得4项10xGenomics平台服务官方认证的公司。博奥晶典目前可开展以下单细胞测序产品和服务：参考文献：
[1]LambdaMoses,LiorPachter，MuseumofSpatialTranscriptomics，.
